艾本森科學(xué)儀器有限公司提供的漩渦振蕩器在對不同的實(shí)驗(yàn)為實(shí)驗(yàn)提供了準(zhǔn)確保障！

原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同Southern Blot相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測。

　　用途：MixPlus漩渦振蕩器在檢測樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量的應(yīng)用。

　　實(shí)驗(yàn)方法：

　　[儀器、試劑、材料]

　　（一）儀器

　　恒溫水浴箱，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)，真空轉(zhuǎn)移儀，真空泵，UV 交聯(lián)儀，雜交爐，恒溫?fù)u床，脫色搖床，MixPlus漩渦振蕩器（合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司），分光光度計，微量移液器，電爐（或微波爐），離心管，燒杯，量筒，三角瓶，等。

　　（二）材料

　　總RNA樣品或mRNA樣品，探針模板DNA（25 ng），尼龍膜

　　（三）試劑

　　NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），瓊脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer， dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，雙氧水, 滅菌水等。

　　[方法與步驟]

　　1. 用具的準(zhǔn)備：

　　180度烤器皿：三角錐瓶、量筒、鑷子、刀片等4小時。

　　電泳槽：清洗梳子和電泳槽，并用雙氧水浸泡過夜，用DEPC水沖洗，干燥備用。

　　處理DEPC水（2 L）備用。

　　2.用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染

　　用RNAZap擦洗梳子，電泳槽，刀片等，然后用DEPC水沖洗二次，去除RNAZap。

　　3.制膠：

　　1）. 稱取0.36mg 瓊脂糖加入三角錐瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波爐加熱至瓊脂糖*熔解。60℃空氣浴平衡溶液 （需加DEPC水補(bǔ)充蒸發(fā)的水分）

　　2）. 在通風(fēng)廚中加入3.6ml的10*Denaturing Gel buffer，輕輕振蕩混勻。

　　注意盡量避免產(chǎn)生氣泡。

　　3）. 將熔膠倒入制膠板中，插上梳子

　　如果膠溶液上存在氣泡，可以用熱的玻璃棒或其它方法去除，或?qū)馀萃频侥z的邊緣。注：膠的厚度不能超過0.5cm。

　　4）.膠在室溫下*凝固后，將膠轉(zhuǎn)移到電泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer蓋過膠面約1cm，小心拔出梳子。（配制250ml　1*MOPS Gel Running buffer，在電泳過程中補(bǔ)充蒸發(fā)的buffer。）

　　5）.檢查點(diǎn)樣孔。

　　4. RNA樣品的制備

　　在RNA樣品中加入3倍體積的formaldehyde load dye和適當(dāng)?shù)腅B（終濃度為10ug/ml）。混勻后，65℃空氣浴15min。短暫低速離心后，立即放置于冰上5min。

　　5. 電泳：

　　1）. 將RNA樣品小心加到點(diǎn)樣孔中。

　　2）. 在5V/cm下跑膠（5x14cm）。在電泳過程中，每隔30min短暫停止電泳，取出膠，混勻兩極的電泳液后繼續(xù)電泳。當(dāng)膠中的溴紛藍(lán)（500bp）接近膠的邊緣時終止電泳。

　　3）. 紫外燈下，檢驗(yàn)電泳情況，并用尺子測量18S、28S、溴紛藍(lán)到點(diǎn)樣孔的距離。

　　注意不要讓膠在紫外燈下曝光太長時間。

　　6. 轉(zhuǎn)膜

　　1）.用3%雙氧水浸泡真空轉(zhuǎn)移儀后，用DEPC水沖洗。

　　2）.用RNAZap擦洗多孔滲水屏和塑膠屏，用DEPC水沖洗二次。

　　3）.連接真空泵和真空轉(zhuǎn)移儀，剪取一塊適當(dāng)大小的膜（膜的四邊緣應(yīng)大于塑膠屏孔口的5mm），膜在Transfer buffer浸濕5分鐘后，放置在多孔滲水屏的適當(dāng)位置。

　　4）.蓋上塑膠屏，蓋上外框，扣上鎖。

　　5）.將膠的多余部分切除，切后的膠四邊緣要能蓋過塑膠屏孔，并至少蓋過邊緣約2mm，以防止漏氣。

　　6）.將膠小心放置在膜的上面，膜與膠之間不能有氣泡。

　　7）.打開真空泵，使壓強(qiáng)維持在50~58mbar;立即將transfer buffer加到膠面和四周。每隔10min在膠面加上1ml transfer buffer，真空轉(zhuǎn)移2小時。

　　8）.轉(zhuǎn)膜后，用鑷子夾住膜，于1x MOPS Gel Running buffer中輕輕泡洗10秒，去除殘余的膠和鹽。

　　9）.用吸水紙吸取膜上多余的液體后，將膜置于UV交聯(lián)儀中自動交聯(lián)。

　　10）.將膠和紫外交聯(lián)后的膜，在紫外燈下檢測轉(zhuǎn)移效率。（避免太長的紫外曝光時間）

　　11）.將膜在-20℃保存。

　　7. 探針的制備

　　1）.在1.5ml離心管中配制以下反應(yīng)液：

　　模板DNA（25 ng） 　　　　1ul

　　Random Primer 2ul

　　滅菌水 11ul

　　總體積：14ul

　　2）.95°C加熱3分鐘后，迅速放置于冰冷卻5min。

　　3）.在離心管中按下列順序加入以下溶液：

　　10×Buffer 2.5ul

　　dNTP Mixture 2.5ul

　　111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 ul

　　Exo-free Klenow Fragment 1 ul

　　4）.混勻后（25ul），37°C下反應(yīng)30分鐘。短暫離心，收集溶液到管底。

　　5）.65°C加熱5min使酶失活。

　　8. 探針的純化及比活性測定：

　　1）.準(zhǔn)備凝膠：將1g凝膠加入30ml的DEPC水中，浸泡過夜。用DEPC水洗滌膨脹的凝膠數(shù)次，以除去可溶解的葡聚糖。換用新配制的TE（PH7.6）。

　　2）.取1ml一次性注射器，去除內(nèi)芯推捍，將注射器底部用硅化的玻璃纖維塞住，在注射器中裝填Sephadex G-50凝膠。

　　3）.將注射器放入一支15ml離心管中，注射器把手架在離心管口上。1600g離心4分鐘，凝膠壓緊后，補(bǔ)加Sephadex G-50凝膠懸液，重復(fù)此步直至凝膠柱高度達(dá)注射器0.9ml刻度處

　　4）.100ul STE緩沖液洗柱，1600g離心4min。重復(fù)3次。

　　5）.倒掉離心管中的溶液后，將一去蓋的1.5ml離心管置于管中，再將裝填了Sephadex G-50凝膠的注射器插入離心管中，注射器口對準(zhǔn)1.5ml離心管。

　　6）.將標(biāo)記的DNA樣品加入25 ul STE，取出0.5ul點(diǎn)樣于DE8　paper上，其余上樣于層析柱上。

　　7）.1600g離心4min，DNA將流出被收集在去蓋的離心管中，而未摻入DNA的dNTP則保留在層析柱中。取0.5ul己純化的探針點(diǎn)樣于DE8-paper.

　　8）. 測比活性（試劑比活要求:106cpm/ml）。

　　9.預(yù)雜交：

　　1）.將預(yù)雜交液在雜交爐中68℃預(yù)熱，并漩渦使未溶解的物質(zhì)溶解。

　　2）.加入適當(dāng)?shù)腢LRAhyb到雜交管中（以100cm2 膜面積加入10mlULRAhyb雜交液），42℃預(yù)雜交4 hr。

　　10.探針變性：

　　1）.用10 mM EDTA將探針稀釋10倍。

　　2）.90℃熱處理稀釋后探針10min后，立即放置于冰上5min。

　　3）.短暫離心，將溶液收集到管底。

　　11.雜交：

　　1）.加入0.5ml ULTRAhyb到變性的探針中，混勻后，將探針加到預(yù)雜交液中。

　　2）.42℃雜交過夜（14~24hr）。

　　雜交完后，將雜交液收集起來于-20℃保存。

　　12.洗膜：

　　1）.低嚴(yán)緊性洗膜：加入Low Stringency Wash Solution#1 （100cm2膜面積加入20ml洗膜溶液），室溫下，搖動洗膜5min兩次。

　　2）.高嚴(yán)緊性洗膜： 加入High Stringency Wash Solution#2 （100cm2膜面積加入20ml洗膜溶液），42℃ 搖動洗膜20min兩次。

　　13.曝光：

　　1）. 將膜從洗膜液中取出，用保鮮膜包住，以防止膜干燥。

　　2）. 檢查膜上放射性強(qiáng)度，估計曝光時間

　　3）. 將X光底片覆蓋與膜上，曝光

　　4）. 沖洗X光底片，掃描記錄結(jié)果。

　　14.去除膜上的探針：將200ml　0.1%SDS（由DEPC水配制）煮沸后，將膜放入，室溫下讓SDS冷卻到室溫，取出膜，去除多余的液體，干燥后，可以保存幾個月。

　　15.雜交結(jié)果

　　操作應(yīng)該小心，但不必緊張。用于RNA電泳、轉(zhuǎn)膜的所有器械、用具均須處理以除去RNAse 酶，以免樣品的降解。轉(zhuǎn)膜時，注意膜和多孔滲水屏之間不要有氣泡